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Técnicas de imunologia diagnóstica

Introdução

Antes de tudo Doc, você sabia que utilizamos muitos dos conceitos da imunologia para identificar doenças? 🤔 Pois é, muito do que estudamos até aqui foi adaptado para que pudéssemos utilizar no meio clínico em exames laboratoriais que nos ajudam no diagnóstico de várias condições. 😮

Assim, a equipe MedSimple 💡 separou um compilado das técnicas de imunologia diagnóstica para você conhecer, veja só: 👇

Quantificação por imunoensaios

Nome complicado, né Doc? 😭 Bom, então vamos tentar simplificar o que esses exames realizam ➡️ eles vão quantificar a concentração de um antígeno ou de um anticorpo através de métodos imunológicos conhecidos como imunoensaios

Dessa maneira, quantificação se dá através da utilização de uma molécula indicadora ou marcadora. Nesse sentido, existem dois tipos principais de imunoensaios 👉 o RIA e o ELISA.

➡️ O radioimunoensaio (RIA) é uma técnica em que se marca um antígeno ou anticorpo utilizando um isótopo radiativo. Assim, é capaz de quantificar a molécula de interesse através de um maquinário que detecta o decaimento (ou meia-vida) daquele isótopo. 

➡️ O ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) é uma técnica em que se marca um antígeno ou anticorpo utilizando uma enzima por ligação covalentemente. Assim, é capaz de quantificar a molécula de interesse através de um maquinário que calcula a taxa em que a enzima converte a molécula/substrato em um produto colorido. 

Variações dos imunoensaios

Esses dois tipos de imunoensaios possuem várias variações, mas a versão mais utilizada é o chamado ensaio sanduíche! 🥪

Este ensaio usa dois anticorpos diferentes que reagem com diferentes epítopos de um único antígeno. Assim, uma quantidade fixa de anticorpos é ligada a uma placa e a solução com o antígeno que deve ser quantificada é adicionada e deixada para se aderir. Posteriormente, é realizado uma “lavagem” para retirar os antígenos que não se ligarem. 🧼

Em seguida, o anticorpo secundário, que pode ser uma enzima ou um radioisótopo, é adicionado também para se aderir, e o antígeno funciona como uma “ponte”. Assim, quanto mais antígeno houver em solução, mais o segundo anticorpo irá se ligar.

  • 📈 Os resultados são utilizados para construir uma curva de ligação para determinar a concentração daquele antígeno. 📈
Doc, veja um esquema de como funciona o chamado “Ensaio Sanduíche” 🥪.
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunologia celular e molecular. 9ª ed. Guanabara Koogna, 2019.

Identificação e purificação de proteínas

Além dos métodos anteriores que comentamos, os anticorpos também podem ser utilizados na identificação de proteínas, bem como para sua purificação em misturas. Assim, podemos utilizar dois métodos 👉 a imunoprecipitação e a cromatografia por imunoafinidade. 

Imunoprecipitação

A imunoprecipitação é uma técnica em que um anticorpo específico para um antígeno, em uma mistura de proteínas, é utilizado para sua identificação. Mas como isso funciona? 🤔

O anticorpo é adicionado à uma mistura de proteínas, com sua porção Fab se ligando às proteínas-alvo. 👩‍🔬 Então, as proteínas que não se ligam ao anticorpo são removidas por lavagem, enquanto a proteína ligada ao anticorpo é eluída das partículas e dissociada do anticorpo através de uma solução específica. Por fim, as proteínas são separadas por eletroforese e adição de um corante permite sua visualização. 👁️

Veja a imagem, Doc! Esse esquema ilustra o funcionamento da imunoprecipitação.
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunologia celular e molecular. 9ª ed. Guanabara Koogna, 2019.

Cromatografia por imunoafinidade

Da mesma forma, a cromatografia por imunoafinidade, é um dos métodos mais comuns! Você já deve ter ouvido falar sobre os testes rápidos, certo? 🧪 É justamente por esse método de purificação em que se fixa anticorpos específicos em um suporte, pelo qual irá passar uma solução com os antígenos desejados misturados com outras proteínas.

Assim, somente o antígeno de interesse se liga ao anticorpo, e as moléculas não ligadas são lavadas. Tal como no método anterior, o antígeno ligado é eluído, mas desta vez por troca de pH ou exposição a altas concentrações de sal, quebrando a ligação entre o antígeno e o anticorpo.

Western blotting

Agora vamos falar um pouco sobre o Western blotting, utilizado para identificar, quantificar e determinar o peso de uma proteína dentro de uma mistura.

Veja só, a mistura de proteínas passa por uma eletroforese em gel, sendo separada conforme seu peso ➡️ as proteínas mais pesadas tendem a se mover menos no campo, enquanto as mais leves viajam para mais longe.

Assim, a posição do antígeno pode ser determinada através da utilização de um anticorpo primário específico, seguindo com um anticorpo secundário (marcado) que se liga ao antígeno preso no anticorpo primário. Tal como na técnica de “sanduíche” 🥪. Em geral, os anticorpos secundários são marcados com enzimas que geram sinais de quimioluminescências e deixam imagens em filmes fotográficos. 📸

  • Ou seja, o primeiro anticorpo “segura” o antígeno no lugar, enquanto o segundo anticorpo “tira uma foto” do antígeno.

Sei que Western Blotting parece complicado, né? Mas Doc, se liga nesse esquema do ABBAS para auxiliar na compreensão.
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunologia celular e molecular. 9ª ed. Guanabara Koogna, 2019.

Detecção de células e purificação

Afinal, somente comentamos sobre como detectar, quantificar e purificar antígenos/anticorpos dispersos em uma solução… mas na vida real sabemos que nem sempre os antígenos estão soltos por aí, certo? 🤔 Além disso, é muito mais comum encontrarmos antígenos/anticorpos de importância fixos em células! 

Por isso, anticorpos específicos para antígenos expressos em tipos celulares específicos podem ser utilizados na identificação de células específicas dentro de uma população misturada. Bem como, são utilizados para a purificação de células dentro de uma mistura.

Citometria de fluxo

O método de identificação de células que iremos comentar é a citometria de fluxo, em que conseguimos determinar a linhagem tecidual e/ou o estado de maturação ou de ativação de uma célula através da análise de moléculas específicas expressas em sua superfície celular ou em seu citoplasma. 

❗ O citômetro de fluxo é o instrumento utilizado nessa avaliação. ❗ Esse maquinário detecta a fluorescência de células específicas em suspensão, quando a molécula está marcada por um anticorpo secundário fluorescente.

Assim, uma suspensão de células é banhada por esses marcadores fluorescentes, que se ligam em moléculas específicas. Então, o citômetro de fluxo mede a quantidade de marcador ligado a cada célula naquela mistura, através da passagem individual da célula por um feixe de laser.

Além disso, os citômetros de fluxo mais modernos são capazes de detectar 3 ou + diferentes sinais fluorescentes coloridos 😱, cada qual ligado a um diferente anticorpo ou marcador. Assim, a técnica permite a análise simultânea da expressão de muitas combinações de diferentes moléculas!

Veja, na imagem abaixo, um esquema de como isso funciona: 👇

Esse esqueminha ilustra a análise simultânea de diversas moléculas! Veja como isso aparece para quem está analisando a amostra.
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunologia celular e molecular. 9ª ed. Guanabara Koogna, 2019.

Classificador de células

O método de purificação de células que iremos comentar é o classificador de células ativado por fluorescência. Essa técnica nada mais é do que uma adaptação da citometria de fluxo 👀 para que seja possível a separação das populações celulares, de acordo com o tipo e quantidade de marcadores fluorescentes nelas ligados. 

Assim, após marcadas, as células são dispostas em um campo eletromagnético que as separa conforme a intensidade do sinal fluorescente.

Identificação de antígeno dentro de tecido ou compartimento celular

Além disso, também podemos utilizar os anticorpos para determinar a distribuição anatômica de um antígeno! 💀 Ou seja, encontrando o marcador dentro de um tecido ou de um compartimento celular.

Para isso, adiciomamos um anticorpo (marcado com fluorocomo ou enzima) no tecido ou célula, o que permite sua visualização através de um microscópio apropriado! 

Imunofluorescência

A versão mais antiga deste método é conhecida como imunofluorescência! Nesta técnica, marcamos as células ou tecidos utilizando um anticorpo fluorescente. Assim, após corados, eram examinados com um microscópio de fluorescência que permitia a localização desse anticorpo.

Hey Doc, veja como as moléculas marcadas por imunofluorescência aparecem à microscopia!
https://laborana.com.br/microscopio-imunofluorescencia.php

Imuno-histoquímica

A mesma ideia é aplicada à imuno-histoquímica, contudo, neste método a detecção de antígenos se dá em cortes histológicos com a utilização de métodos de “sanduíche” dos anticorpos 🥪, com o secundário emitindo a marcação vista à microscopia específica.

Aqui um exemplo de imuno-histoquímica! Veja como as colorações se dão de forma diferenciada, para que um patologista seja capaz de, no caso da imagem, determinar o tipo de carcinoma de mama.
https://drarosanadenardi.com.br/classificacao-imuno-histoquimica-2/

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Referências

  1. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunologia celular e molecular. 9ª ed. Guanabara Koogna, 2019.
  2. Abbas AK, Lichtman AH. Imunologia básica. 3ª ed. Elsevier: Rio de Janeiro, 2015.
  3. Salomão, Reinaldo. Infectologia: bases clínicas e tratamento. 1ª ed. Guanabara Koogna: Rio de Janeiro, 2017.

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